D產(chǎn)品貨號(hào)：354143 354144 354147 354148

儲(chǔ)存和運(yùn)輸：-20度儲(chǔ)存，干冰運(yùn)輸。

操作指南：

血管生成過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞活化后表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），可降解血管基底膜。BD Biocoat內(nèi)皮細(xì)胞侵襲系統(tǒng)提供了抗/促血管再生化合物的體外定量實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?nèi)皮細(xì)胞侵襲系統(tǒng)包括：BD Falcon 24多孔板培養(yǎng)小室，含配套接收板和蓋子：BD FluoroBlok熒光屏蔽3.0μm孔徑PET膜，預(yù)包被Matrigel基質(zhì)。具體操作步驟如下：

凍融：

從-20℃冰箱中取出包裝，使其自然升溫到室溫。

遷移實(shí)驗(yàn)：用BD鈣黃綠素Calcein AM熒光染色劑后標(biāo)記

細(xì)胞在BD FluoroBlokTM 基質(zhì)膜遷移后，采用熒光標(biāo)記定量，只有遷移到下室的細(xì)胞可以計(jì)算得到。根據(jù)實(shí)時(shí)動(dòng)力曲線的計(jì)算，推薦使用前標(biāo)記法。

2.1 原代HUVEC細(xì)胞的遷移能力取決于其來(lái)源和所傳代數(shù)。可以先對(duì)HUVEC遷移能力進(jìn)行預(yù)篩選，推薦使用所傳代數(shù)較低，8代以內(nèi)的HUVEC。

2.2 HUVEC細(xì)胞在血清培養(yǎng)基或生長(zhǎng)因子VEGF優(yōu)化的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，會(huì)對(duì)不同的內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)劑產(chǎn)生不同的應(yīng)激反應(yīng)。

建議在實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞饑餓4-5小時(shí)，而后去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，清洗細(xì)胞單層，加入含0.1%BSA的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不含血清或生長(zhǎng)添加劑）。

2.3 HUVEC細(xì)胞懸液可用胰酶消化后制備，然而，采用非酶技術(shù)消化細(xì)胞，更能保存細(xì)胞遷移的應(yīng)激能力。可采用專業(yè)培養(yǎng)基Specialty Media (產(chǎn)品號(hào)：S-014-B)作為非酶消化的離散劑。

注意：大部分內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基不具有足夠的血清濃度用于終止胰酶的消化。

2.4 接種細(xì)胞濃度同實(shí)驗(yàn)條件，如細(xì)胞來(lái)源，培養(yǎng)基，化學(xué)誘導(dǎo)物決定。推薦起始濃度為：4.0×105 cells/mL 24孔板或3.3×105個(gè)/mL 96孔板。推薦接種體積分別為250μL和75μL.

2.5 推薦的化學(xué)誘導(dǎo)物體積分別為24孔板，750微升，96孔板，225微升。

注意：為了減少氣泡和優(yōu)化熒光讀板的性能，推薦通過(guò)進(jìn)樣口在配套板內(nèi)添加試劑。

2.6 小室和對(duì)照小室在37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)22±1小時(shí)。

3、細(xì)胞遷移的計(jì)算：用BD鈣黃綠素Calcein AM 熒光染色劑后標(biāo)記定量。

注意：鈣黃綠素的濃度在4-5μg/mL（HBSS溶液）。采用培養(yǎng)基用于熒光染色劑的稀釋會(huì)引起熒光染色劑自動(dòng)水解，并帶來(lái)高背景熒光。

對(duì)一塊完整的24孔板來(lái)說(shuō)，需要一管溶解于12.5mL HBSS的50μg的染色劑。96孔板則需要2管溶解于25mL HBSS的50μg染色劑。

3.1 在各管50μg鈣黃綠素中加入20 μL DMSO，加入150μL 37℃預(yù)熱的HBSS。將其轉(zhuǎn)入大量的HBSS中，用150μL預(yù)熱的HBSS清洗熒光染料的容器。

3.2標(biāo)記有2種方法

*種適用于大規(guī)模孔板的自動(dòng)化加樣操作。小室和孔板內(nèi)的培養(yǎng)基通過(guò)加樣口添加。通過(guò)進(jìn)料口加入HBSS清洗孔板和膜底部（24孔板需500μL,96孔板需200μL），反復(fù)抽吸。在24孔板中加入500μL鈣黃綠素，96孔板中加入225μL。

第二種方法是手動(dòng)操作較水?dāng)?shù)量的培養(yǎng)板。取出培養(yǎng)小室，輕搖后去除溶液。去除培養(yǎng)基后，將小室轉(zhuǎn)入另一塊新的培養(yǎng)板，該培養(yǎng)板在、預(yù)先溶有染色劑（24孔板，每孔500μL，96孔板每孔225μL）。

3.3 在37℃，5%CO2環(huán)境下孵育90分鐘。

3.4 培養(yǎng)小室的熒光定量信息通過(guò)熒光板讀板機(jī)底部讀數(shù)取得，激發(fā)波長(zhǎng)494nm ，發(fā)射波長(zhǎng)517nm。只有遷移后通過(guò)Martigel FluoroBlok膜的被標(biāo)記的細(xì)胞才能被檢測(cè)。

4、遷移研究：DilC12(3)熒光染色預(yù)標(biāo)記法

細(xì)胞接種于孔板之前先用染色劑標(biāo)民，可用于均一化實(shí)驗(yàn)，所產(chǎn) 生的實(shí)時(shí)動(dòng)力數(shù)據(jù)可提示細(xì)胞通過(guò)基底膜侵襲的動(dòng)力曲線，不需要分解和破壞各個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

4.1 如1.所示凍融。

4.2 不同濃度的各類熒光素對(duì)細(xì)胞標(biāo)記的程度不同，標(biāo)記濃度和時(shí)間，接種細(xì)胞濃度和化學(xué)誘導(dǎo)劑必須預(yù)先優(yōu)化。

4.3 接種密度參見(jiàn)步驟2.在小室內(nèi)加入0.5 mL 37℃預(yù)熱的基本培養(yǎng)基，在37℃，CO2環(huán)境下孵育15-45分鐘，待用。

4.4 培養(yǎng)小室的熒光定量信息通過(guò)熒光板讀板機(jī)底部讀數(shù)取得，激發(fā)波長(zhǎng)549nm，發(fā)射波長(zhǎng)565nm。只有遷移后通過(guò)Matrigel FluoroBlok膜的被標(biāo)記的細(xì)胞才能被檢測(cè)。

5、結(jié)果計(jì)算

注意：數(shù)據(jù)可以用相對(duì)熒光值RFU或遷移百分比表示，后者在標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)處理中更有用。

背景扣除：計(jì)算平均背景值，將其從各個(gè)孔板中扣除。

遷移百分比%=受化學(xué)誘導(dǎo)的跨膜遷移的細(xì)胞平均熒光值/不受化學(xué)誘導(dǎo)的跨膜遷移的細(xì)胞平均熒光值×100

自動(dòng)化操作注意事項(xiàng)

1 BD Falcon FluoroBlok 24孔板培養(yǎng)小室系統(tǒng)能適用于自動(dòng)化操作系統(tǒng)。蓋子可以用標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械手取走，也可用吸力取走。

2 為了避免各孔間污染，孔板設(shè)定為一個(gè)統(tǒng)一的方向。為了培養(yǎng)小室匹配，確保Falcon的商標(biāo)均在2者上方，面向同一個(gè)方向。

3 對(duì)于96 孔板培養(yǎng)小室，需使用錐形頭或窄孔口的吸頭。寬口槍頭會(huì)粘在儲(chǔ)存口上，不利操作。

4 任何規(guī)格的槍頭都能達(dá)到小室的兩邊。包括50μL，100μL， 200μL，250μL，1000μL。