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當(dāng)前位置:首頁技術(shù)文章Matrigel 使用指南及常見疑問

Matrigel 使用指南及常見疑問

更新時(shí)間:2014-05-05點(diǎn)擊次數(shù):2300

Matrigel 收貨注意事項(xiàng),請檢查:

1.       盒子內(nèi)是否有干冰

2.       基質(zhì)膠是否呈固態(tài),膠面是否水平

3.       基質(zhì)膠顏色是否在正常范圍(黃色-粉紅-深紅)

產(chǎn)品特性 :

Martrigel基質(zhì)會(huì)有色差變化(淡黃色到深紅色),是由于酚紅和碳酸氫鹽與CO2的作用引起的,但是與5%CO2平衡后色差即會(huì)減少。

基質(zhì)膠凍融操作

收貨后,若不立刻使用基質(zhì)膠,應(yīng)馬上將仍然是冷凍固態(tài)的基質(zhì)膠放進(jìn)-20冰箱保存。使用前須先將基質(zhì)膠凍融。

凍融:

將基質(zhì)膠埋于鋪滿碎冰的冰盒中,然后將整冰盒放入4冰箱溶解一夜。(普通濃度的基質(zhì)膠,溶解時(shí)間1-2天;高濃度基質(zhì)膠溶解時(shí)間 3-7天)。

分裝:

溶解后的須分裝保存,以避免反復(fù)凍融。液態(tài)基質(zhì)膠,會(huì)在10以上快速成膠(特別是高濃度基質(zhì)膠),因此,分裝時(shí),接觸到基質(zhì)膠的耗材必須預(yù)冷(如移液管、吸頭、EP管等),并且整個(gè)實(shí)驗(yàn)必須無菌、冰上操作。(高濃度的基質(zhì)膠比較粘稠,用移液器不好吸取,可以使用去掉針頭的預(yù)冷注射器吸取。)

 

保存:

分裝后的基質(zhì)膠在冰上應(yīng)仍然呈現(xiàn)液態(tài),此時(shí)將基質(zhì)膠放進(jìn)-20保存即可。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí),取出分裝好的小管,4凍融。若分裝好后基質(zhì)膠已經(jīng)凝固,說明分裝操作不能很好地保持低溫,導(dǎo)致基質(zhì)膠已經(jīng)成膠,不適宜使用。

普通濃度基質(zhì)膠操作

包被與成膠

細(xì)胞可在0.5mm厚度的基質(zhì)膠表面生長,可以在1mm厚度的三維基質(zhì)內(nèi)生長。過度稀釋的基質(zhì)膠會(huì)形成非膠質(zhì)的蛋白層,可以用于細(xì)胞貼壁,但不能用于細(xì)胞的研究分化。為保證基質(zhì)膠的成膠性能與穩(wěn)定,稀釋濃度不應(yīng)低于13,可用預(yù)冷無血清培養(yǎng)基稀釋,成膠后立即使用。

薄膠成膠方法:

1.凍融后,用預(yù)冷的移液槍頭混勻基質(zhì)膠成勻漿狀。

2.  將需要使用的培養(yǎng)板置于冰上,加入濃度為50ul/cm2生長面積的基質(zhì)膠。

3.  37放置30min,即可使用。

厚膠成膠方法

1.      凍融后,用預(yù)冷的移液槍頭混勻基質(zhì)膠成勻漿狀。

2.      將需要使用的培養(yǎng)板置于冰上,將培養(yǎng)的細(xì)胞與基質(zhì)膠混合,用移液槍頭使其懸浮于基質(zhì)中。加入濃度為150-200 ul/cm2生長面積的基質(zhì)膠。

37放置30min,可成膠。也可以加入細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì),也可使細(xì)胞直接生長在膠表面。

薄層包被方法:

1.     凍融后,用預(yù)冷的移液槍頭混勻基質(zhì)膠成勻漿狀。

2.     根據(jù)需要,采用無血清培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定*包被濃度。

3.     將稀釋的基質(zhì)膠包被與所需的培養(yǎng)器皿中,包被量至少覆蓋整個(gè)器皿的生長表面,室溫下孵育1小時(shí)。

去除未結(jié)合的基質(zhì)膠,用無血清培養(yǎng)基輕輕地沖洗。備注:普通濃度的基質(zhì)膠,建議稀釋濃度不低于3mg/ml;我們不能保證稀釋濃度低于3mg/ml能夠成膠。

普通濃度的基質(zhì)膠,不建議用于成瘤實(shí)驗(yàn)。

BD細(xì)胞回收劑354253,離散酶354235,冰浴7小時(shí)后回收得到細(xì)胞。

腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn):

操作過程

1.     凍融(對于預(yù)包被的24孔培養(yǎng)小室請參考1.1-1.3操作,對于自己包被好待用的24孔小室,請直接從步驟2開始)

1.1  -20冰箱中取出產(chǎn)品,使其自然升溫到室溫。

1.2  取出培養(yǎng)板在細(xì)胞小室內(nèi)加入500μL 37預(yù)熱的PBS37CO2環(huán)境下孵育2小時(shí)。

1.3  解凍后,小心去除小室內(nèi)的培養(yǎng)基,避免破壞Matrigel基質(zhì)膜。

 

2.     染色劑后標(biāo)記法

細(xì)胞通過侵襲消化基質(zhì)膜后遷移到下小室,采用熒光標(biāo)記定量細(xì)胞。細(xì)胞的侵襲能力用終點(diǎn)計(jì)算法計(jì)算得到。對于采用實(shí)時(shí)動(dòng)力曲線的計(jì)算,推薦使用前標(biāo)記法。

2.1 如步驟1 準(zhǔn)備培養(yǎng)板。

2.2 胰酶消化細(xì)胞單層后制得細(xì)胞懸液,溶于無血清DMEM培養(yǎng)基,推薦濃度為5×104cells/mL

2.3 上小室中加入500μL細(xì)胞懸液(2×104 cells)。

2.4 通過進(jìn)樣口在下小室中加入750μL誘導(dǎo)劑。

2.5 375% CO2 條件下孵育培養(yǎng)板和對照板20-22小時(shí)(由細(xì)胞類型決定)。

2.6 孵育后,小心去除上小室中的培養(yǎng)基及基質(zhì)膠,避免破壞小室的膜及膜底侵襲轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。

2.7 將培養(yǎng)小室轉(zhuǎn)移到另一塊24孔板中,結(jié)晶紫或鈣黃綠素染色。計(jì)算。

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