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Human sCD141 ELISA Kit
更新時間：2015-03-16
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產品名稱：Human sCD141 ELISA Kit
中文名稱：人cd141 ELISA 檢測試劑盒
生產廠家：法國Diaclone
貨號：950.720.096
Human sCD141 ELISA Kit
(中文說明書供參考，請以到貨的英文說明書為準)
用途：人sCD141 ELISA試劑盒用于體外定量檢測人血清，血漿，緩沖液或細胞培養液中的sCD141,試劑盒可用于檢測天然和重組的人sCD141,此試劑盒只用于科研，不能用于診斷。
檢測原理：
sCD141試劑盒應用的是夾心法固相酶聯免疫吸附分析法（ELISA）。sCD141特異單克隆抗體被包被于微孔板上，已知sCD141濃度的標準品和未知濃度的樣品可在此反應孔中進行檢測。先將sCD141抗原和生物素標記sCD141特異單克隆抗體同時孵育。洗滌后加入親和素過氧化物酶，孵育后洗去未結合的酶。其后加入底物，產生顏色反應，顏色的深淺與樣品中sCD141的濃度成一定的比例關系。
試劑盒組成及配制：
試劑（2-8℃保存） | 1x96孔的配置 產品編號：#873.020.096 | 配制 |
96T微孔板 | 1 | 即用型(已包被) |
塑料板蓋 | 2 | |
標準品：20ng/ml | 2瓶 | 按瓶上的說明稀釋（見試劑制備，） |
標準品稀釋緩沖液 | 1瓶（25ml） | 10X濃度，用純水稀釋 |
對照 | 2 | 按瓶上的說明稀釋（見試劑制備，） |
生物素標記cd141抗體 | 1瓶(0.4ml) | 用生物素標記抗體稀釋液稀釋（見試劑制備） |
生物素標記抗體稀釋液 | 1瓶(7ml) | 即用型 |
親和素-HRP | 2支(5ul) | 0.5ml HRP稀釋液預稀釋（見試劑制備，） |
HRP稀釋液 | 1瓶(23ml) | 即用型 |
洗滌緩沖液 | 1瓶(10ml) | 200x，蒸餾水稀釋（見試劑制備） |
TMB | 1瓶(11ml) | 即用型 |
H2SO4終止液 | 1瓶(11ml) | 即用型 |
自備材料：
蒸餾水；加樣器：10ul, 50ul, 100ul, 200ul, 1000ul; 漩渦振蕩器和磁力攪拌器
保存條件：
試劑盒保存于2-8度，
樣品收集，處理和保存：
- 細胞培養上清：1000xg離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
- 血清——操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000xg離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
- EDTA，檸檬酸鹽和肝素血漿可用于檢測。1000Xg離心30分鐘去除顆粒。
- 如果樣品不直接使用，將其分為小部分（250-500ul）-70℃下保存，避免反復凍融。
如果可能，不要使用溶血和高脂血。如果血清中有大量的顆粒，檢測前先離心或過濾。
注意：不要在37℃或56℃加熱解凍。在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍
實驗方案：
用前所有試劑置于常溫
標準品/對照 pg/ml | 樣品 | |||||||||||
A | 20 | 20 | ||||||||||
B | 10 | 10 | ||||||||||
C | 5 | 5 | ||||||||||
D | 2.5 | 2.5 | ||||||||||
E | 1.25 | 1.25 | ||||||||||
F | 0.625 | 0.625 | ||||||||||
G | 空白 | 空白 | ||||||||||
H | 對照 | 對照 | ||||||||||
試劑準備：
- 洗滌緩沖液（200x）的稀釋：蒸餾水200倍稀釋成1X的工作液。
- 標準品稀釋液的制備：用前加入225ml純水，2-8度可保存一周以上。
- 標準品的制備：按標準品瓶上的說明，加入標準品稀釋液，稀釋后濃度為20ng/ml。溫柔上下顛倒混勻。直接在檢測板上對校準品做系列稀釋，濃度范圍：20-0.625ng/ml。每次重新做實驗，都需要重新做標準曲線。吸取200ul重懸后的標準品到A1, A2孔（1000pg/ml），取100ul標準品稀釋液到B1, B2, C1, C2, D1,D2, E1,E2, F1, F2孔。從A1, A2孔吸取100ul到B1, B2孔，用加樣器反復吸排使其混合。小心不要擦到孔的內表面。同樣從B1, B2孔吸取100ul到C1,C2；再從C1,C2到D1,D2等，從zui后的兩個孔（F1, F2）中吸去100ul不要。這樣從A1,A2到F1,F2，cd141標準品稀釋液的濃度為20ng/ml到0.625ng/ml。也可在試管中進行此稀釋，將稀釋后的標準品直接加入反應孔中。
- 樣品制備：在檢測前，人血清或血漿樣本需要用標準品稀釋液1:2稀釋。
- 生物素標記cd141抗體的制備：
生物素標記抗cd141的稀釋：每次實驗前準備。根據實驗的孔數，以生物素標記抗體稀釋液稀釋。稀釋量見下表。
反應孔的數量 | 生物素標記抗體（ul） | 生物素標記抗體稀釋液（ul） |
16 | 40 | 1060 |
24 | 60 | 1590 |
32 | 80 | 2120 |
48 | 120 | 3180 |
96 | 240 | 6360 |
- 親和素-HRP的稀釋：5ul 親和素-HRP加入0.5ml HRP稀釋液, 每次實驗前準備，不要保存此稀釋后液體。根據反應孔的數量進一步稀釋，見下表。
反應孔的數量 | 親和素-HRP(ul) | 親和素-HRP稀釋液(ml) |
16 | 30 | 2 |
24 | 45 | 3 |
32 | 60 | 4 |
48 | 75 | 5 |
96 | 150 | 10 |
檢測程序
使用前，將所有試劑充分混合，不要使液體產生泡沫。根據樣品數量加上空白，標準品決定所需的板條，每個樣品，標準品，空白和質控都應做雙份。
詳細步驟 | |
1 | 制備標準曲線 |
2 | 按實驗方案在對應孔加入100ul標準品和樣本,標準品，樣本及空白孔,對照均做復孔。 |
3 | 加入50ul生物標記的cd141抗體到各孔 |
4 | 用塑料膜封板，室溫（18-25.℃）孵育1小時。 |
5 | 去掉封板膜，按以下程序洗板：
|
6 | 加入100ul親和素-HRP溶液到各孔 |
7 | 用封板膜，封板，室溫（18-25.℃）孵育30min |
8 | 重復步驟5 |
9 | 加入100ul即用型TMB底物溶液至各孔 |
10 | 室溫避光孵育10-15min，用鋁箔包住反應板， 避免光照。 |
11 | 加入100ul H2SO4到各孔，終止反應。 |
在分光光度計中讀取結果。450nm作為初始波長，620nm作為參考波長。 | |
注：制備的生物素標記抗cd141及親和素-HRP應立即使用。
結果分析
以吸光度為Y軸，相應的cd141標準品濃度為X軸做標準曲線。樣品的cd141含量可根據其O.D.值由標準曲線推斷出來。
局限
不要在超出標準曲線檢測范圍，推測樣本的檢測值，超出檢測范圍的樣本值不呈線性。高濃度的樣品請用標準品稀釋液或自備的樣品稀釋液稀釋至標準曲線檢測范圍，然后樣品實際測值再乘以對應的稀釋倍數。
不同藥物會影響檢測結果。細菌或真菌及實驗室交叉污染，都可導致不規律的檢測數據。
不正確或不充分的洗滌都可以導致假陽性或假陰性結果。
靈敏度：
zui小的人cd141檢測濃度小于0.31ng/ml。
精密度：
批內：
批間：
檢測過程：（總時長1h45min）
加100ul樣品或稀釋標準品或對照及50ul生物素標記的cd141抗體
↓
室溫孵育1h
↓
洗滌三次
↓
加入100ul親和素-HRP
↓
室溫孵育30min
↓
洗滌三次
↓
加入100ul TMB，避光顯色12-15min
↓
加入100ul H2SO4
↓
|
450nm讀取吸光度
